釀酒用酵母菌的篩選與鑑定


資料來源:農政與農情  所屬地區:台灣

一、前言
  酵母菌在釀酒、食品與醫療工業上扮演重要的角色,酵母菌含有豐富的蛋白質、維生素等養分,可以提取輔酶A、細胞色素C、腺核酶三磷酸 (ATP) 等生化原料產品,也可以利用酵母菌來生產維生素、胺基酸或有機酸等代謝產物,當然,最重要且普遍的用途之一是釀酒。相傳在神農時代,中國人的祖先就懂得種植黍、稷、稻、麥、菽等五穀利用酒麴來造酒,文獻上也曾記載大禹時代夷狄造酒,可見得我們的祖先很早就知道如何利用酵母菌等微生物進行釀造。

二、釀酒酵母菌的應用與篩選
  釀酒的酵母菌學名為Saccharomyces cerevisiae,意思是吃糖的菌,cerevisiae在拉丁文中意為發酵,顧名思義,酵母菌最喜歡的食物就是各式各樣的糖類,包括蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖等。因此在含糖分較高的水果表面、花粉、花蜜、蔬菜上常常可以尋獲,在葡萄的果皮表面也有很多的酵母菌,這就是葡萄可以自然發酵變成葡萄美酒的原因。雖然酵母菌有很長的名字,但是酵母菌卻是極小的生物,只能在顯微鏡下觀察,估計約200億個酵母菌細胞才重約一公克。天然酵母菌在自然界分布很廣,近年來各國食品界興起了一股尋找各式天然酵母菌的風潮,從野花、漿果等不同來源植物分離純化酵母菌,並測試這些酵母菌進行麵包製作或釀酒的風味,就是為了能發展出特殊的產品。


圖1 田間栽培的葡萄表面存在各種酵母菌種(左),破碎去梗榨汁後(中),可以從葡萄汁中分離出不同菌種(右)。

三、酵母菌的鑑定
  天然酵母菌曾被人類觀察記載的種類據統計約有七百多種,未曾被觀察發現的種類則估計超過數十萬種,傳統鑑定酵母菌的方法必須綜合形態特徵、芽孢分生方式、生化鑑定或是由不同的篩選培養基區分,且需要豐富的經驗。在分子生物學興起之後,由分子層次進行酵母菌分子標誌分析輔以傳統分類學方法進行鑑定已經成為主流。

(一)核糖體基因序列鑑定法

  在分子層次的鑑定方法中,利用聚合?連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)擴大複製核糖體基因(ribosomal DNA)的內轉錄間隔區(Internal transcribed spacer, ITS)是最常被使用的方法。核糖體基因為一呈縱線排列頭尾相連的重複性基因,每個重複單元包含了小次單元(16-18 S)、大次單元(23-28 S)及5.8 S基因,這些解碼區(coding region)被內轉錄間隔區ITS隔開。大、小次單元由外間隔區(External spacer)或稱基因間隔區區隔(Inter-genic spacer, IGS),5.8S基因則位於內轉錄間隔區中。由於身兼細胞中所有蛋白質生合成的任務,核糖體基因在不同物種間的演化相當保守(conservation)且在基因組中數量豐富,因此常被用來鑑別不同種的微生物。

  科學家很早就發現,不同的酵母菌種其ITS片段大小有所差異,從約400到800鹼基對(base pair)都有,因此由PCR擴大複製ITS序列後,由長度便可初步區分酵母菌可能的種類。接著可以利用限制酶對ITS序列作進一步辨識,如果基因序列呈現變化,所切出來的片段大小也有所不同。圖3 由ITS長度可先區分酵母菌種類圖4 利用限制?Hinf I(上)與Hae III(下)可以將ITS切成八種不同大小片段型式。
圖2 核糖體基因結構圖

  上述的鑑別工具相當簡便,在一天內就可以完成,然而片段大小的資訊終究有限,面對眾多的未知菌種,需要更豐富的資訊來作進一步確認。在圖5中顯示了六種葡萄表面酵母菌的ITS部分序列,其中Major是葡萄發酵七天後僅存的酵母菌,也就是Saccharomyces cerevisiae,在發酵過程中因為產生高量的酒精,使其他酵母菌因為不耐酒精而紛紛死亡,最後主宰了發酵過程。其他1到5的菌種分別是Candida bombi、C. stellata CBS 157、Starmerella aff. bombicola JJ-14、C. cf. stellata 10-372、C. zemplinina EJ1,其中C. bombi和C. stellata為同屬不同種,從ITS片段長短以及限制酶分析都無法區分,但是進行定序之後,可以看出這兩個菌種有相當大的差異(圖5中編號1及2),顯示出基因序列豐富的資訊價值。

(二)其他分子鑑定法

  但即使將ITS序列完全解出,面對眾多的商業酵母菌,ITS序列仍有不足之處,粒線體基因是另一個可用之工具。粒線體是生物細胞中負責代謝養分產生能量的胞器,有自己獨立的基因組,可以將細胞破碎後離心分離出粒線體,再抽取全部基因利用限制酶切碎電泳比較。酵母菌的粒線體基因組大小約85Kb,利用限制酶分析酵母菌S. cerevisiae之粒線體片段長度多型性,可以看出不同商業酵母菌菌系之間的差異。圖6為自食品工業研究所購買供測之8種S. cerevisiae商業酵母菌菌系(Lane1-8),分別是(1) Cote des blancs, Red Star、(2) Pasteur champagne, Red Star、(3) Flor sherry, Red Star、(4) Montrachet, Red Star、(5)Sauvigonon, DSM、(6) L-2226, Lalvin、(7) KL-1116, Lalvin、(8) RC212, Lalvin。

  其他可以利用的分子鑑定工具包括常見的微衛星體序列大小(SSR)、擴大複製片段長度多型性(AFLP)、逢機複製片段長度多型性(RAPD)等技術,因限於篇幅無法一一介紹,可以確定的是由於分子生物學的進展,大幅拓展了傳統生物學的研發應用領域。

四、結語
  台灣在加入WTO後正式結束菸酒專賣制度,鑑於921地震對中部地區造成極大的災情,政府為了輔導災區產業重建,於89年就災區先行開放水果釀酒事業,並於2002年訂定「農村酒莊輔導作業要點」,目前農委會所屬研究機關也積極研發釀酒技術,並篩選本土天然菌種以期能為酒莊產業發展奠定良好基礎,相信國人的智慧與努力必可為國內酒莊及相關水果產業開創另一番成就。圖5 不同種酵母菌的ITS序列資訊,進行序列比對後可以發現歧異大及保守的區域,有豐富的資訊價值圖6 同樣的發酵用菌種S. cerevisiae,不同商業品系可以用粒線體基因限制片段長度多型性來分析。

〈摘錄自農政與農情第151期〉

酵母菌是一種微小的單細胞菌類,肉眼無法看到,必須使用顯微鏡才能觀察得到。比起一些大型的真菌類,例如洋菇、香菇等可食性蕈類,或造成食物腐敗的黴菌,例如麵包黴、麴黴等,似乎是較不易讓人注意到它的存在。但事實上,酵母菌與人類生活的關係卻可遠朔自二千多年前的埃及。而時至今日,我們還是利用酵母菌來釀酒與烘製麵包,科學的進步似乎並沒有找到一種更好的東西來替代酵母菌,而酵母菌的功能卻還在持續的被發現中。





酵母菌屬於真菌類,但與一般真菌類具有細長的菌絲不同,它只有單細胞。大小約僅有十μm左右,形狀有橢圓、柱形、長形,一般以橢圓形較常見。在釀酒的地區,橢圓酵母菌是最重要的種類。它可將葡萄糖轉變成酒精,雖然此種酵母菌無法以人工大量培養,不過它生存在土壤中,會自然附在果實上並隨之進入釀酒的大桶中。在某些生長條件下,酵母菌也可以形成一長串細胞連成的假菌絲。



酵母菌的生殖方式有無性生殖與有性生殖二種,無性生殖包括出芽生殖與分裂生殖。而有性生殖則有三種情形:一種是形成子囊孢子,這種酵母菌被歸為子囊菌。另一種是形成擔孢子,類似菇類的擔孢子,這類酵母菌被歸入擔子菌。而最後一種酵母菌,因為它們的有性生殖至今尚不了解,所以被歸入不完全菌。如此可知,酵母菌的分類是依據其有性生殖的方式來分類。



但是平常我們觀察酵母菌並不容易見到它們的有性生殖,而且它們的外觀也相當簡單,所以我們並無法只依酵母菌的外觀特徵就將酵母菌鑑定出來,必須再運用另外一種生理鑑定的方法─以酵母菌對營養需求的不同來分類。目前對酵母菌的分類主要依據下列幾項項目,包括:菌類外觀與產生的色素、形成子囊孢子或擔孢子、細胞的大小、發酵能力、澱粉產生的能力等。



在自然界中酵母菌的分佈非常廣泛,從天寒地凍的極區經溫帶到熱帶的沙漠都可以發現它們的蹤跡。因為酵母菌不具葉綠素不能自己行光合作用,所以必須利用分解有機質產生的能量來生活。



通常酵母菌是生長在含糖分的物質上,譬如植物的果實、樹葉、樹幹、花蜜腺上是最常見的。曾有學者發現,在一顆葡萄的表面就生長了一百萬個酵母菌。而在昆蟲或高等動物的腸道、分泌物中,也能發現到酵母菌的蹤跡。甚至是在空氣、土壤中也有酵母菌存在。酵母菌在土壤中是靠什麼生活呢?即使是由植物根部滲出或者是動物體分解後產生的少量糖分也足夠賴以為生了。有人研究世界各地土壤中的酵母菌發現,它們的種類與數目會因不同的氣候、土壤類型、季節變化而有所不同。



酵母菌除了能在土壤、空氣中、植物體、動物體中生存外,還能生存在我們的食物上。例如,牛奶、乳酪、肉類等,使食物因而腐敗。但也能因它在分解食物的過程中產生芳香酯類,而具有特殊的香味。例如,豆腐乳、豆鼓、味增都是利用酵母菌發酵所製成的產品。另外還有一些酵母菌會寄生在動物體內造成病害。



  由於酵母菌本身含有豐富的蛋白質,對人類與動物來說甚具營養,所以製糖公司常將製糖產生的糖蜜用來培養酵母菌,做成酵母片或酵母粉,是大眾皆宜的營養產品。



  由於酵母菌可以行無氧呼吸將糖發酵成酒精與二氧化碳,所以自古就被拿來釀酒與製造麵包。除了酒精之外,酵母菌的其他代謝產物,像脂肪、維生素B2、解脂脢等,都可以應用在工業與醫學上



菌物界

菌物界生物(簡稱菌類)的細胞具有細胞壁,但卻沒有葉綠體,因此不能行光合作用,必須從外界獲得養分。

菌類依營養方式分為腐生菌和寄生菌:

腐生菌可分解動、植物屍體和碎屑,使元素很快回歸自然,再被植物利用;其與細菌和原生菌類同為自然界中重要的分解者。

寄生菌會使動、植物和人類生病或死亡,人類的香港腳即是由菌類感染所引起。

菌類大多為多細胞,其個體由菌絲構成,菌絲會侵入寄主或附著物內,分泌酵素,使食物分解為小分子後,再行吸收。

菌絲頂端可產生孢子,藉由孢子的飄散以繁殖。

臺灣地處亞熱帶和熱帶,氣候溼熱,因此菌類種類繁多,而且容易生長繁殖。

在溼熱的環境中食物很快的腐敗,衣物、皮革、木材或塑膠品也很容易長黴,這些絨毛狀的黴便是菌絲。

菌絲多呈白色,但孢子則有各種顏色,如麵包黴有黑色的孢子;青黴有綠色的孢子。

青黴所分泌的青黴素,可以抑制細菌生長,是一種有效的抗生素。

單細胞的酵母菌置於糖溶液中:

在有氧的情況下,可將糖分解,產生水和二氧化碳,並快速行出芽生殖。

在缺氧時,酵母菌也可以分解糖而產生酒精和二氧化碳,此過程稱為酒精發酵。



人們所飲用的葡萄酒、各種水果酒、啤酒等,便是將果汁、稻米或麥粒等,經酵母菌的發酵作用產生酒精釀造而成。

發酵作用所產生的二氧化碳可以使焙製的麵包、糕餅鬆軟,酒精則在焙製時逸出。

生長於枯木、腐枝或地面上的腐生菌類,有:

可以食用的,如木耳、 白木耳、草菇、洋菇、香菇、金針茹和竹蓀等。

可當藥材的,如靈芝。

有劇毒的,如紅托鵝膏,誤食嚴重者會導致死亡。

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